【项目评估】

基因组信息分析

**  [ Homo sapiens (human) ]

Gene ID: **, updated on 2-Aug-2020

**基因具有3个转录本NR_002**.2 、NR_131**.1、NR_131**.1。需要在转录本的重叠位置设计靶点，进行敲除，3转录本具有多个重复区域，可以设计出合适靶点。

细胞株分析

细胞敲除是否成功细胞培养影响很大，要求细胞株可以持续传10代以上不能分化，而且需要较好的增值能力（因为需要培养细胞克隆），细胞增值慢实验周期会比较长，本实验方案使用A375细胞株，可以达到实验要求。

【项目报告】

1、基因组信息

Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p7 Primary Assembly

NCBI Reference Sequence:**

在第2-5显子上下游分别设计靶位点（外显子红色字体）

     7621 gcgctgcacc catcccagaa tcccccaccc tggaaccccc atcccccttt tcatgtactc

     7681 ctccccatgc cccccagccc ccctctgccc aaggctggcc tcccccacat catgcccaca

     7741 gcccggattc cagagtcctc gagacaaatt gctgtaacag tgtttattga tgatgagtcc

     7801 agggctcctg ctgaagccct ggtggggagg ggcacagagc gagatggggc gtaatggaat

     7861 gcttgaaggc tgctccgtga tgtcggtcgg agcttccaga ctaggcgagg gcagggtgag

……

     8881 aggaaggccg gacgcgcctc ctctgtcctc gccgtcacac cggaccatgt catgtcctgc

     8941 ttgtcacgtc caccggacct ggcgtcttgg ccttcggcag ctggtgggca cgtccacccc

     9001 agctggagac ctggctgtgg ggagaacgag agagtcgtgt ggggagaacg tgttggttgt

     9061 gtggggaggg gcgggtgggg gctgagggtg gcagaggggg aaaaactcac cctcgtctcc

     9121 agcccgaacg ctgaggcacc gatcccggct ccgtcgccgc ccgcgaggcc cgccttggcc

靶点设计：

在线工具：http://crispr.mit.edu/

上游

Target-1

GACTCTGGAATCCGGGCTGT

Target-2

GGACTCTGGAATCCGGGCTG

下游

Target-3

GTCCGGTGGACGTGACAAGC

Target-4

GGCCAAGACGCCAGGTCCGG

2、构建载体px458- **-T1、px458- **-T2、 px458-**-T3和px458- **-T4

3、转染

（1）去内毒素质粒提取（详细步骤参见PureLink™ HiPure Plasmid FP (Filter and Precipitator) Maxiprep Kit）

（2）转染（步骤详细参见Lipofectamine® 3000 Reagent）

（3）流式分选转染阳性细胞

（4）细胞克隆培养

将转染回收的GFP阳性细胞，采用极度稀释的方法，将细胞放入10cm培养皿中培养，带观察到明显的细胞克隆，将细胞细胞克隆传代至96孔板，再继续传代至6孔板。

如图：

（5）活性检测

PCR产物凝胶琼脂糖电泳检测显示，第6和第8细胞克隆靶位点区域条片段缺失较大，将6与8细胞克隆测序进一步检测靶点突变情况。

4、测序鉴定

PCR扩增**靶位点序列，测序筛选，最终筛选得到**基因大片段敲除的细胞克隆。