科研服务 时间：2020-07-17 15:43:00 浏览：15286次
3499拉斯维加斯经过10多年的发展，获得了上百种细胞株和四十余种原代细胞培养经验，并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库。细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件，万级净化细胞房，这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。 同时，3499拉斯维加斯结合多年原代及传代细胞培养经验，结合平台已有的技术优势，建立了完善的体外药筛实验，并引进RTCA(Real-time cellular Analysis，实时无标记细胞记录仪），在药筛过程中，全程实时记录细胞真实状况，为药筛提供最真实精准的实验数据。
无菌操作注意事项
细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。
新西兰大白兔膝关节软骨细胞原代分离培养
操作方法
（1）取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。
（2）移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。
（3）PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。
（4）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
（5） 4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2H；
（6）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞,
放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（7）细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。
细胞形态
膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。
大鼠膝关节软骨细胞的原代培养
操作方法
（1）取四周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离大腿腿骨，尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织；从关节处分离出软骨组织，将其剪成小于1mm3的组织块，用含双抗的PBS溶液冲洗两遍。
（3）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，往离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
（4） 4℃静置5min；弃上清，加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化30～60min；
（5）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞,
放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（7）放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。每3天更换培养液至第5天改为无血清培养液。免疫组化鉴定原代细胞。
细胞形态
膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。
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